免疫親和柱是一種基于抗原-抗體特異性識別與結合原理進行樣品前處理的固相萃取技術。其核心部件是將特異性抗體固定于惰性載體上所形成的層析介質。該技術旨在從復雜樣品基質中高選擇性、高效地捕獲單一目標物或一類結構相似的化合物，從而實現高度特異性的凈化與富集。操作流程的科學性與規范性直接決定了其選擇性效能。
一、操作流程的核心技巧
規范且精細的操作是發揮高特異性的基礎，其過程通常包含柱預處理、上樣、淋洗與洗脫四個關鍵步驟，每一步均有需關注的技術要點。
柱預處理：此步驟旨在使固相載體達到適合抗體發揮較佳結合活性的物理與化學狀態。通常使用緩沖溶液對柱介質進行平衡，以提供適宜的離子強度和pH環境，并移除儲存溶液。平衡液的選擇應考慮抗體與抗原結合的較佳條件。預處理的另一個關鍵功能是潤濕整個柱床并排除內部氣泡，以確保樣品溶液能夠均勻、充分地與固定化抗體接觸。預處理液的流速不宜過快，以保證充分的平衡時間。
上樣階段：這是特異性捕獲發生的核心環節。樣品需經過適當的預處理，以使其基質條件與上樣緩沖液兼容，并去除可能堵塞柱床的顆粒物。上樣流速是重要參數，過快的流速可能導致目標物與抗體接觸時間不足，結合不充分；過慢則可能延長非特異性吸附時間。通常建議采用較低且穩定的流速。對于結合容量明確的情況，上樣量不應超過柱子的標稱結合容量。若樣品中目標物濃度未知或可能過高，應考慮預先稀釋或減少上樣體積。
淋洗階段：該步驟旨在去除通過非特異性作用吸附在載體或抗體上的基質干擾物，同時保留通過特異性識別結合的目標物。淋洗緩沖液的組成至關重要，其離子強度、pH值及有機溶劑含量需經過優化，使其足以洗脫非特異性結合的雜質，但不會破壞抗原-抗體的特異性結合。通常需要使用兩種或以上的淋洗液進行分步清洗，強度由弱漸強。淋洗體積需充足，確保雜質被有效移除，但同樣需避免過度淋洗導致目標物損失。淋洗后，可將柱子短暫干燥或增加一個低強度緩沖液沖洗步驟，以去除殘留的淋洗液，為洗脫創造更純凈的環境。
洗脫階段：此步驟要求將特異性結合的目標物從抗體上有效解離并收集。洗脫條件需能打破抗原-抗體間的非共價鍵合力，同時盡量減少對目標物或抗體活性的破壞。常見的洗脫策略包括使用低pH緩沖液、高鹽溶液、有機溶劑或含有競爭性結合劑的溶液。洗脫液的體積應盡可能小，以實現高倍數富集，但必須保證能將目標物洗脫。洗脫流速也需適當控制，以保證充分的解離時間。收集的洗脫液有時需立即進行pH中和或稀釋，以保持目標物的穩定。
二、關鍵注意事項
溫度與時間控制：操作環境溫度應保持穩定，避免過高或過低影響抗體活性及反應動力學。部分操作步驟的孵育時間需按說明書或優化方案嚴格控制。
避免交叉污染：不同批次或針對不同目標物的免疫親和柱必須明確區分，操作過程中使用的容器、移液器具等需潔凈，防止交叉污染導致特異性下降。對于重復使用的親和柱，需嚴格按照再生和儲存規程操作。
介質保存與穩定性：未使用的親和柱需按照說明書要求條件儲存，通常需冷藏。已預處理但未上樣的柱子不宜長時間暴露于非儲存環境中?？贵w是具有生物活性的蛋白質，應避免反復凍融、劇烈振蕩或接觸蛋白酶。
性能驗證：對于關鍵分析，建議通過加標回收實驗等方式定期驗證捕獲效率與特異性，監測其性能是否衰減。
通過嚴謹遵循上述操作技巧與注意事項，可以更大程度地發揮免疫親和柱基于分子識別的固有高選擇性，有效分離目標分析物與復雜基質，為后續高靈敏、高準確度的分析檢測提供高質量的樣品前處理保障。
